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狐狸源大肠杆菌应用抗生素和中草药的疗效研究

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  随着抗生素在畜牧养殖业中的不合理应用, 耐药菌株层出不穷, 尤其产超广谱β-内酰胺酶耐药菌株的出现, 给畜牧养殖业造成了极大的经济损失[1,2]。在动物养殖业中, 危害较大的致病菌有大肠杆菌、沙门氏杆菌、绿脓杆菌等, 而大肠杆菌又是极易产生耐药性的细菌之一, 如何解决养殖动物大肠杆菌耐药问题已经成为目前研究的热点[3]。因此, 研发具有天然、高效、绿色、不良作用低的药物既可防治细菌性疾病, 又符合当代绿色养殖的目标[4]。大量的研究结果表明, 某些中草药和抗生素联用不仅能够提高药物的抑菌作用, 而且也能够抑制部分耐药菌株的出现[5]。中草药是中国特有的、丰富的药材资源, 有“天然抗生素”的美称, 其具有来源广泛、品种繁多、价格低廉、成分复杂、不良作用小、不易使细菌产生耐药性、易于代谢等优点, 受到了养殖工作者的信赖和喜爱[6]。基于此, 笔者选择从河北省昌黎县某养殖场分离的狐狸源大肠杆菌作为试验菌株, 考察2种抗生素和4种中草药的体外抑菌活性, 以期为日常动物养殖合理用药提供参考。

  1、材料

  1.1、试验药物

  苏木、诃子、五味子、秦皮, 均购自秦皇岛民乐医药连锁有限责任公司;庆大霉素、头孢曲松粉末, 河北省预防兽医学重点实验室保存。

  1.2、试验菌株

  致病性大肠杆菌, 分离自秦皇岛昌黎县某养殖厂患病死亡的狐狸肝脏, 河北省预防兽医学重点实验室保存。

  1.3、主要仪器与试剂

  冰箱 (型号为BCD-649WDCE) , 购自青岛海尔股份有限公司;隔水式恒温培养箱 (型号为GHP-9080) , 购自上海一恒科学仪器有限公司;全自动高压灭菌锅 (型号为G154DWS) , 购自致微 (厦门) 仪器有限公司;超净工作台 (型号为YT-CJ-1D) , 购自北京亚泰隆仪器技术有限公司;96孔细菌培养板, 购自杭州微生物试剂有限公司;营养琼脂 (NA) 、营养肉汤 (NB) , 均购自青岛高科园海博生物技术有限公司。

  2、方法

  2.1、中草药药液的制备

  采用水煎法提取中草药苏木、诃子、五味子、秦皮的有效成分。首先称取这4种中草药各50 g, 加入纯化水500 mL, 浸泡1 h;煎煮30 min后改用文火煮1 h, 纱布过虑;得到的药渣加入300 mL水继续煎煮30 min, 过滤;合并2次得到的滤液, 加热浓缩至50 mL, 最终得到的药液浓度为1 g/mL, 经过高压灭菌、分装后4 ℃保存, 备用。

  2.2、头孢曲松、庆大霉素药液的制备

  精密称量头孢曲松、庆大霉素于容量瓶中, 加入灭菌的磷酸盐缓冲溶液 (PBS) , 制成终浓度为1 280 μg/mL的药液, 用孔径为0.22 μm的滤器过滤该药液, 得到的药液4 ℃保存, 备用。

  2.3、菌液的制备

  用灭菌的接种环蘸取狐狸源致病性大肠杆菌菌液, 无菌涂布于伊红美蓝培养基上, 置于37 ℃隔水式恒温培养箱中培养12 h后无菌挑取单个菌落于6 mL营养肉汤液体培养基中培养12 h。采用平板法计数, 最终将菌液浓度稀释至1×107 cfu/mL。

  2.4、最小抑菌浓度 (MIC) 的测定

  运用微量肉汤二倍稀释法测定4种中草药和2种抗生素的MIC值。取无菌96孔细菌培养板, 将第1孔至第12孔分别加入营养肉汤200 μL;在第1孔中加入药液200 μL, 混匀, 吸取200 μL至第3孔中, 再次混匀, 直至第11孔, 混匀后吸取200 μL液体弃去;接着每孔加入菌液 (菌液浓度为1×107 cfu/mL) 10 μL。每种药物做3个重复, 以第12孔为对照, 将培养基置于隔水式恒温培养箱中培养24 h[7]。结果判定:肉眼观察, 未见细菌生长时药物的最小浓度即为MIC。

  2.5、最小杀菌浓度 (MBC) 的测定

  从各个药物的MIC和所有大于MIC浓度的微孔中各吸取菌液100 μL到NA培养基上点板, 37 ℃培养12 h, 观察有无菌落生长, 无菌落生长的相应微孔中的最低药物浓度即为该药物对狐狸源大肠杆菌的MBC[8]。

  2.6、中草药与抗生素联用的联合抑菌浓度 (FIC) 指数的测定

  采用微量肉汤棋盘稀释法测定4种中草药和2种抗生素联用的MIC值。具体操作步骤如下:取出96孔细菌培养板, 以狐狸源大肠杆菌临床分离株作为试验菌株。根据单药的MIC值, 以2 MICA (A药MIC的2倍) 为最高浓度, 吸取100 μL沿着96孔板横轴依次倍比稀释至1/16 MICA (A药MIC的1/16) , 以2 MICB (B药MIC的2倍) 为最高浓度沿着96孔板纵轴同样倍比稀释, 直到1/16 MICB (B药MIC的1/16) 后每孔加入菌液 (菌液浓度为1×107 cfu/mL) 10 μL, 置于微量振荡器上震荡2 min, 然后将培养基置于37 ℃隔水式恒温培养箱中培养12 h, 测定2种药物联用时的MIC[9]。FIC指数= (A药联用时的MIC/A药单用时的MIC) + (B药联用时的MIC/B药单用时的MIC) 。

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Tags: 大肠杆菌?中草药?抗生素?疗效?狐狸 ?
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